ELECTROFORESIS

Electroforesis.

 La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.

También es una técnica para la separación de moléculas que se basa en la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico; estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo, en dependencia de una combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional, la ventaja de la electroforesis es la separación, visualización y cuantificación del número de proteínas de una solución, pero esta también afecta la estructura de las proteínas por lo tanto, afecta a la función de la misma.

Métodos electroforéticos zonales.

Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido, que se impregna con una solución tampón. Los  soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos  de convección del solvente. 

 Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros.  Este método tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la  longitud del trayecto es mucho mayor  que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple, fuente de poder,  cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos.

Electroforesis en gel  de poliacrilamida.

 Los geles de poliacrilamida se forman por  polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.

Electroforesis en geles de agarosa.

 La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos.

Factores que afectan la electroforesis.

-       Carga neta.

-       Tamaño.

-       Intensidad del campo eléctrico.

-       Temperatura.

-       Medio soporte.

-       Buffer.

Espectrofotometria

Muchas técnicas analíticas que se emplean en laboratorios de química clínica incorporan los principios de instrumentación espectrofotométrica. La espectrofotometría se utilizan los patrones característicos de absorbancia  de radiación electromagnética para identificar los analitos de interés. Cuando se conoce el patrón espectral se usa la longitud de onda luminosa la cual la absorbancia es máxima, cuantificar dicha sustancia en solución.

Características de la luz.

Debido que la espectrofotometría comprende mediciones con detectores de la radiación electromagnética que se trasmite, es fundamental conocer las principales características de la radiación electromagnética, la luz es una forma visible de radiación electromagnética; o sea que se comporta como si tuviera campos eléctricos y magnéticos oscilados en planos perpendiculares entre si.

Características de la longitud de onda.

La luz, como toda radiación electromagnética, está formada de fotones o paquetes de energía (E) que viajan en ondas. El espectro electromagnético se describe en términos de longitud de onda.

La longitud de onda del espectro electromagnético es la distancia entre los máximos de ondas sucesoras. En el sistema internacional se mide en nanómetros (nm), el número de ondas por el segundo se denomina frecuencia. La longitud de onda se relaciona inmensamente con la energía, mientras mayor es la longitud de onda es menor el número de fotones que contiene. En otras palabras la longitud de onda larga es de baja energía, de manera similar la longitud de onda corta posee más energía.

Espectro electromagnético.

Es el rango de todas las radiaciones electromagnéticas posibles. El espectro de un objeto es la distribución característica de la radiación electromagnética de ese objeto.

El espectro electromagnético se extiende desde las bajas frecuencias usadas para la radio moderna (extremo de la onda larga) hasta los rayos gamma (extremo de la onda corta), que cubren longitudes de onda de entre miles de kilómetros y la fracción del tamaño de un átomo. Se piensa que el límite de la longitud de onda corta está en las cercanías de la longitud Planck, mientras que el límite de la longitud de onda larga es el tamaño del universo mismo, aunque en principio el espectro sea infinito y continuo.

Espectro ultravioleta.

La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 380nm. Posee una región de energía muy alta, provoca daños al ojo humano, la región UV es importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos. 

Espectro visible.

Se describe como el rango de longitudes de ondas visibles a simple vista. Esta región va de 380 a 700 nm, se obtiene un espectro continuo con un color visible distinto que corresponde a determinada porción de longitud de onda.

El color visible de una solución corresponde a la longitud de onda que trasmite, no que se absorbe, el color que se absorbe es el complementario del color que se trasmite, por tanto, para efectuar mediciones de absorción es necesario utilizar longitud de onda a la cual la solución colorida absorbe luz.
 

Radiación infrarroja.

Se emplea sobre todo en análisis toxicológicos.

 Ley de Beer.

La mayoría de las medidas espectrofotométricas se basan en la ley de Beer, la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida, e inversamente proporcional al logaritmo de la luz trasmitida y se expresa matemáticamente así.

A = a.b.c. = 2 – log % T donde:

A = absorbancia.

a = absortividad o coeficiente de absorción.

b = longitud de paso de la luz en centímetros.

c = concentración de la sustancia en interés.

%T = porcentaje de transmitancia.

Absorbancia.

Este compuesto es sinónimo de densidad óptica, se define como la cantidad de energía radiante que una sustancia absorbe a determinada longitud de onda.

Transmitancia.

Es la cantidad de energía radiante que trasmite o deja pasar una sustancia a una determinada longitud de onda.

Espectrofotometría:

Es la medición de la intensidad de la energía radiante en estrecho intervalo de longitud de onda del espectro. Para la selección de la longitud de onda se utilizan rejillas de difracción o prisma.

Fotometría

Es el procedimiento por el cual se efectúan mediciones de energía radiante utilizando filtro para aislar parte del espectro.

Pruebas colorimétricas.

Blanco reactivo

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Casi todos los reactivos poseen una coloración que tendrán una absorbancia que tienen que ver con el color original que este trae, por lo tanto necesitamos eliminarla para no aumentar la absorbancia de la muestra. Así que sirve para eliminar la absorbancia propia del reactivo, esta resta puede realizarse de manera manual o automáticamente con el fotocolorímetro o espectrofotómetro.

Blanco de muestra.

Es un tubo que se monta utilizando agua destilada y se usa para eliminar la absorbancia propia de la muestra en los casos que se esta presente, hemolisis, ictericia o lipemia.

Blanco de aire.

Es realizarle un cero de absorbancia al equipo para eliminar cualquier inferencia.

Estándar.

Es una solución patrón que tiene una concentración conocida de un determinado metabolito y se utiliza para comparar su color con el de la muestra, y lo más importante, para calcular la concentración del metabolito en estudio en la muestra examinada, a través de la siguiente formula en la ley de Beer.

Concentración        = absorbancia de la muestra          

De la muestra            …………………………………..     X  la concen del estándar.

                                     Absorbancia del estándar.

Cromatografia

La cromatografía es uno de los principales métodos para la separación de especies químicas estrechamente relacionadas en mezclas complejas. La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil.

En todas las separaciones cromatográficas la muestra se disuelve en una fase móvil, que puede ser un gas un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible, la cual se mantienen fija en una columna o sobre una superficie sólida. Las fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son retenidos con más fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo; por el contrario los componentes que unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.